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If pressed repeatedly, the button increases the percentage of saturated pixels. The Reset button makes the maximum 0 and the minimum 255 in 8-bit images and the maximum and minimum equal to the smallest and largest pixel values in the images histogram for 16-bit images. If the Auto button does not produce a desirable result, use the region-of-interest (ROI) tool to select part of the cell and some background, then hit the Auto button again. The stretch will then be based on the intensities of the ROI. Pressing the Apply button permanently changes the actual grey values of the image. If just analyzing image intensity do not press this button. If you prefer the image to be displayed as black on white rather than white on black, then use the inverted command: Image Lookup Tables Invert LUT . The command Edit Invert inverts the pixel values themselves permanently. Getting intensity values from single ROI If working with a stack, the ROI selected can be analyzed with the command: Image Stacks Plot Z Axis Profile . This generates a single column of numbers - one slice intensity per row. The top 6 rows of the column are details of the ROI. This makes sure the same ROI is not analyzed twice and allows you to save any interesting ROIs. The details are comprised of area, x-coordinate, y-coordinate, AR, roundness, and solidity of the ROI. If the ROI is a polylinegtfreehand ROI rather than a squaregtoval, it acts as if the ROI is an ovalgtsquare. The (oval) ROI can be restored by entering the details prompted by the Edit Selection Restore Selection (hotkey: Ctrl Shift E ) command. The results are displayed in a plot-window with the ROI details in the plot window title. The plot contains the buttons List, Save, Copy. The Copy button puts the data in the clipboard so it can be pasted into an Excel sheet. The settings for the copy button can be found under Edit Options Profile Plot Options . Recommended settings include: Do not save x-values (prevents slice number data being pasted into Excel) and Autoclose so that you dont have to close the analyzed plot each time. Dynamic intensity vs Time analysis The plugin Plot Z Axis Profile (this is the Z Profiler from Kevin (Gali) Baler (gliblr at yahoo) and Wayne Rasband simply renamed) will monitor the intensity of a moving ROI using a particle tracking tool. This tool can be either manual or automatic. Use the Image Stacks Plot Z Axis Profile command. Getting intensity values from multiple ROIs You can analyze multiple ROIs at once with Bob Doughertys Multi Measure plugin. The native ROI manager function does a similar job except doesnt generate the results in sorted columns. Check Bobs website for updates. The Multi Measure plugin that comes with the installation is v3.2. Open confocal-series and remove the background (See Background correction) Generate a reference stack for the addition of ROIs. Use the Image Stacks Z-project function and select the Average . Rename this image something memorable. Open the ROI Manager plugin ( Analyze Tools Roi Manager or toolbar icon). Select ROIs and Add to the ROI manager. Click the Show All button to help avoid analyzing the same cell twice. After selecting ROIs to be analyzed in the reference image, you can draw them to the reference image by clicking the Moregtgt button and selecting Draw . Save the reference image to the experiments data folder and then click on the stack to be analyzed. Click the Moregtgt button in the ROI manager and select the Multi Measure button to measure all the ROIs. Click Ok . This will put values from each slice in to a single row with multiple columns per slice. Clicking on Measure all 50 slices will put all values from all slices and each ROI in a single column. Go to the Results window and select the menu item Edit Select All. . Then Edit/Copy . Go to Excel and paste in the data. Check that everything was pasted in correctly 10. To copy ROI coordinates into the Excel spreadsheet, there needs to be an empty row above the intensity data. Use the Multi Measure dialog and click the Copy list button. 14. In Excel, click the empty cell above the first data column and paste in the ROI coordinates. Save the ROIs with the Multi Measure button Save . Put them in the experimental data folder. The ROIs can be opened later either individually with the button Open or all at once with the button Open All . Oval and rectangular ROIs can be restored individually from x, y, l, h values with the Plugins ROI Specify ROI. mando. Ratiometric imaging compares the recordings of two different signals to see if there are any similarities between them. It is done by dividing one channel by another channel to produce a third ratiometric channel. This technique is useful because it corrects for dye leakage, unequal dye loading, and photo-bleaching. An example application would be measuring intracellular ion, pH, and voltage dynamics in real time. Background subtraction is needed before analysis of dual-channel ratio images. See also the background correction section. The RatioProfiler plugin will perform ratiometric analysis of a single ROI on a dual-channel interleaved stack. The odd-slices are channel 1 images and the even slices are channel 2 images. If your two channels are opened as separate stacks, such as Zeiss, the two channels can be interleaved (mixed together by alternating between them) with the menu command Plugins Stacks - Shuffling Stack Interleaver . The plugin will generate a green-plot of the ratio values. Ch1Ch2 is the default and you can get Ch2Ch1 if the plugin is run with the Alt key down. It will also generate a second plot of the intensities of the individual channels, Ch1 and Ch2, as well as a results table. The first row of the results table contains values for the x, y, width and height of the ROI. From the second row downward, the first column is the time (slice number), the second column is the Ch1 mean intensity, and the third channel is the Ch2 mean intensity and the ratio value. The stack must have its frame interval calibrated in order for the Time value to be in seconds. Otherwise, it is Slices. The frame interval can be set for the stack via the menu command Image Properties . This table can be copied to the clipboard and pasted elsewhere with the Edit Copy All menu command. Ratio Analysis Using ROI manager 1.Subtract the background from the image. 2. Open ROI manager ( Analyze Tools ROI manager. ) and click the Show All button. 3. Select the cells to be analyzed and add them to the ROI manager (Add button or keyboard T key). 4. Run the plugin. The results window contains the mean of ch1 and ch2 and their ratio. Each row is a timepoint (slice). The first row contains the ROI details. To generate a reference image: Flatten the stack with the menu command ( Image Stacks Z-project with Projection type: Maximum), Adjust the brightness and contrast if necessary. Select the new image and click the More button in the ROI manager. After that select Label. Obtaining timestamp data Zeiss LSM The LSM Toolbox is a project aiming at the integration of common useful functions around the Zeiss LSM file format, that should enhance usability of confocal LSM files kept in their native format, thus preserving all available metadata. In Fiji, corresponding commands are: File Import Show LSMToolbox which displays the toolbox, from which all commands can be called and Help About Plugins LSMToolbox. which displays information about the plugin. Biorad This reading can be found by using the menu command Image Show Info. . Scroll down to get the time each slice was acquired. Select this time, copy it into Excel, and find the time number obtained by using the Excel menu command Edit Replace . This will leave only the time data. The elapsed time can then be calculated by subtracting row 1 from all subsequent rows. Linescanning involves acquiring a single line, one pixel in width, from a common confocal microscope instead of a standard 2D image. This is usually a faster way to take an image. All the single pixel-wide images are then stacked to recreate the 2D image. A pseudo-linescan generation of a 3-D ( x, y, t ) image. It is useful for displaying 3-D data in 2 dimensions. A line of interest is drawn followed by the command: Image Stacks Reslice or with the keyboard button /. It will ask you for the line width that you wish to be averaged. It will generate a pseudo-linescan stack with each slice representing the pseudo-linescan of a single-pixel wide line along the line of interest. Average the pseudo-linescan stack by selecting Image Stacks Z-Project. and use the Average command. A poly-line can be utilized, but this will only generate a single pixel slice. Fijis default settings assume that stacks are z - series rather than t - series. This means that many functions related to the third-dimension of an image stack are referred to with a z - . Just keep this in mind. FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) Analysis The FRAP profiler plugin will analyze the intensity of a bleached ROI over time and normalize it against the intensity of the whole cell. After that it will find the minimum intensity in the bleached ROI and fit the recovery with this point in mind. Open the ROI manager. Draw around the bleached ROI and add it to the ROI manager. Draw around the whole cell and add that to the ROI manager. The normalization corrects for the bleaching that occurs during image acquisition and assumes the whole cell is in the field of view. The plugin assumes the larger of the two ROIs in the ROI manager is the whole cell ROI and that the smaller ROI is the bleached part. Run the FRAP profiler plugin. The plugin will return the intensity vs time plot, the normalized intensity vs time plot of the bleached area, and the curve fit. Non-linear contrast stretching Equalization You can have more control over brightness and contrast adjustments with the Process Enhance contrast menu command. With a stack, it analyzes the each slices histogram to make the adjustment. The Equalize contrast command applies a non-linear stretch of the histogram based on the square root of its intensity. Gamma Gamma performs a non-linear histogram adjustment. Faint objects become more intense while bright objects do not (gamma lt1). Also, medium-intensity objects become fainter while bright objects do not (gamma gt 1). The intensity of each pixel is raised to the power of the gamma value and then scaled to 8-bits or the min and max of 16-bit images. For 8 bit images New intensity 255 (old intensity255) gamma Gamma can be adjusted via the Process Math Gamma command. It will allow you to adjust the gamma with the scroll bar. Click on Ok when you are finished. You can use the Scroll-bar to determine the desired gamma value on one slice of your stack. There is also an option to preview the results. See the online reference for an explanation of digital filters and how they work. Filters can be found using the menu command Process Filters. . Mean filter . the pixel is replaced with the average of itself and its neighbors within the specified radius. The menu item Process Smooth is a 33 mean filter. Gaussian filter . This is similar to a smoothing filter but instead replaces the pixel value with a value proportional to a normal distribution of its neighbors. Median filter . The pixel value is replaced with the median of itself and its adjacent neighbors. This removes noise and preserves boundaries better than simple average filtering. The menu item Process Noise Despeckle is a 33 median filter. Convolve filter: This allows two arrays of numbers to be multiplied together. The arrays can be different sizes but must be of the same dimension. In image analysis this process is generally used to produce an output image where the pixel values are linear combinations of certain input values. Minimum: This filter, also known as an erosion filter, is a morphological filter that considers the neighborhood around each pixel and, from this list of neighbors, determines the minimum value. Each pixel in the image is then replaced with the resulting value generated by each neighborhood. Maximum: This filter, also known as a dilation filter, is a morphological filter that considers the neighborhood around each pixel and, from this list of neighbors, determines the maximum value. Each pixel in the image is then replaced with the resulting value generated by each neighborhood. Kalman filter . This filter, also known as the Linear Quadratic Estimation, recursively operates on noisy inputs to compute a statistically optimal estimate of the underlying system state. Background correction can be done in multiple ways. A simple method is to use the Image Lookup Tables HiLo LUT to display zero values as blue and white values (pixel value 255) as red. With a background that is relatively even across the image, remove it with the Brightness/Contrast command by slowly raising the Minimum value until most of the background is displayed blue. Press the Apply button to make a permanent change. Rolling-Ball background correction To fix an uneven background use the menu command Process Subtract background . This will use a rolling ball algorithm on the uneven background. The radius should be set to at least the size of the largest object that is not part of the background. It can also be used to remove background from gels where the background is white. Running the command several times may produce better results. The user can choose whether or not to have a light background, create a background with no subtraction, have a sliding paraboloid, disable smoothing, or preview the results. The default value for the rolling ball radius is 50 pixels. Process Subtract Background.